ວິທີການສັງເຄາະໄລຍະແຂງຂອງ Melanotan I

ຄວາມເປັນມາ

Melanotan I, ເຊິ່ງເອີ້ນກັນວ່າ Afamelanotide, ແມ່ນ polypeptide ເສັ້ນຊື່ທີ່ປະກອບດ້ວຍອາຊິດ amino 13 ທີ່ກຽມພ້ອມທີ່ຈະມີບົດບາດສໍາຄັນເພີ່ມຂຶ້ນໃນການຄົ້ນຄວ້າທາງຢາ. ຊື່ພາສາອັງກິດຕົ້ນຕໍສໍາລັບ Melanotan I ແມ່ນ Melanotan-1 ແລະ Afamelanotide. ໃນຖານະເປັນການປຽບທຽບສັງເຄາະຂອງ α-melanocyte-stimulating hormone α-MSH), Melanotan I ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປິ່ນປົວຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງ photosensitivity ທີ່ເກີດຈາກ erythropoietic protoporphyria. ໃນປັດຈຸບັນ, ຜະລິດຕະພັນ Melanotan I ສ່ວນໃຫຍ່ຖືກຕິດສະຫຼາກສໍາລັບການນໍາໃຊ້ການຄົ້ນຄວ້າເທົ່ານັ້ນແລະຍັງບໍ່ທັນມີຈຸດປະສົງສໍາລັບການນໍາໃຊ້ຂອງມະນຸດ. ໃນການສັງເຄາະໄລຍະແຂງແບບດັ້ງເດີມ, ທາງເລືອກຂອງຢາງພາລາມີຜົນກະທົບຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຕໍ່ປະສິດທິພາບການເຊື່ອມໂລຫະແລະຄວາມບໍລິສຸດສຸດທ້າຍຂອງຜະລິດຕະພັນ.

ຂໍ້ມູນພື້ນຖານ

ຊື່​ຈີນ​: Melanotan 1​
ຊື່ພາສາອັງກິດ: Melanotan-1
ໝາຍເລກບໍລິສັດ: GT-A006
CAS No.: 75921-69-6
ລຳດັບ: SYS{Ne}EH{D-Phe}RWGKPV-NH2
ສູດໂມເລກຸນ: C78H111N21O19
ນ້ຳໜັກໂມເລກຸນ: 1646.88

 ວິທີການກະກຽມ

I. ການກະກຽມຂອງ Fmoc-Val-Amino Resin

ຂັ້ນຕອນທີ 1:ນໍ້າໜັກ 11.11g (5mmol) ຂອງ Ramage Amide AM resin ທີ່ມີລະດັບການທົດແທນຂອງ 0.45mmol/g ແລະເພີ່ມມັນໃສ່ເຕົາປະຕິກອນໄລຍະແຂງ. ຕື່ມ DCM ເພື່ອໃຄ່ບວມສໍາລັບ 30 ນາທີ, ຫຼັງຈາກນັ້ນລ້າງ. ລ້າງສາມເທື່ອດ້ວຍ DMF. ຕື່ມການແກ້ໄຂ DMF ທີ່ມີ 20% piperidine (v/v) ແລະປະຕິກິລິຍາເປັນເວລາ 5 ນາທີ. ເພີ່ມອີກ 20% piperidine DMF ການແກ້ໄຂແລະປະຕິກິລິຍາສໍາລັບ 10 ນາທີ, ດ້ວຍການລ້າງ DMF ຫນຶ່ງໃນລະຫວ່າງ. ຫຼັງຈາກປະຕິກິລິຢາສໍາເລັດ, ລ້າງແລະລ້າງສາມຄັ້ງດ້ວຍ DMF.

ຂັ້ນຕອນທີ 2:ລະລາຍ 5.09g ຂອງ Fmoc-Val-OH, 2.02g ຂອງ HOBT (1-hydroxybenzotriazole), ແລະ 2.32ml ຂອງ DIC (N,N'-diisopropylcarbodiimide) ໃນ DMF ທີ່ 0 ° C. ຫຼັງຈາກການລະລາຍຢ່າງສົມບູນ, ຕື່ມການປະສົມກັບຖັນຕິກິຣິຍາແລະປະຕິກິລິຍາໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງສໍາລັບ 1 ຊົ່ວໂມງ. ຕິດຕາມຄວາມຄືບຫນ້າຂອງຕິກິຣິຍາໂດຍໃຊ້ການທົດສອບ ninhydrin, ຮັບປະກັນຜົນໄດ້ຮັບທາງລົບ. ຫຼັງຈາກປະຕິກິລິຍາສໍາເລັດ, ລ້າງສາມເທື່ອດ້ວຍ DMF ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ Fmoc-Val-amino resin.

II. ການ​ກະ​ກຽມ​ຂອງ​ການ​ປົກ​ປັກ​ຮັກ​ສາ​ຢ່າງ​ເຕັມ​ສ່ວນ Peptide ຢາງ​ຂອງ Melanotan I.

ຂັ້ນຕອນທີ 1:ເພີ່ມ 20% piperidine ໃນການແກ້ໄຂ DMF (ອັດຕາສ່ວນປະລິມານ) ກັບ Fmoc-Val-aminoresin ຂ້າງເທິງ. ປະຕິກິລິຍາເປັນເວລາ 5 ນາທີ, ຫຼັງຈາກນັ້ນຕື່ມສ່ວນອື່ນຂອງ 20% piperidine ໃນການແກ້ໄຂ DMF ແລະປະຕິກິລິຍາສໍາລັບ 10 ນາທີ. ລ້າງຄັ້ງດຽວດ້ວຍ DMF ໃນລະຫວ່າງໄລຍະ. ຫຼັງຈາກຕິກິຣິຍາສໍາເລັດແລ້ວ, ໃຫ້ແຫ້ງພາຍໃຕ້ສູນຍາກາດແລະລ້າງສາມເທື່ອດ້ວຍ DMF.

ຂັ້ນຕອນທີ 2:ລະລາຍ 5.06g Fmoc-Pro-OH, 2.02g HOBT (1-hydroxybenzotriazole), ແລະ 2.32ml DIC (N,N'-diisopropylcarbodiimide) ໃນ DMF ທີ່ອຸນຫະພູມ 0°C. ຫຼັງຈາກການລະລາຍຢ່າງສົມບູນ, ຕື່ມການປະສົມກັບຖັນຕິກິຣິຍາແລະປະຕິກິລິຍາໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງສໍາລັບ 1 ຊົ່ວໂມງ. ຕິດ​ຕາມ​ກວດ​ກາ​ຄວາມ​ຄືບ​ຫນ້າ​ຂອງ​ການ​ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ​ໂດຍ​ນໍາ​ໃຊ້​ການ​ທົດ​ສອບ ninhydrin (ການ​ທົດ​ສອບ Kaiser​) ຈົນ​ກ​່​ວາ​ໄດ້​ຮັບ​ຜົນ​ລົບ​. ເມື່ອສໍາເລັດ, ລ້າງສາມເທື່ອດ້ວຍ DMF ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ Fmoc-Pro-Val-aminoresin.

ຂັ້ນຕອນທີ 3:ປະຕິບັດຕາມວິທີການທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ໃນຂັ້ນຕອນທີ 2, ຈັບຄູ່ອາຊິດ amino ແຕ່ລະອັນຕາມລໍາດັບຂອງ Melanotan I. ຫຼັງຈາກສໍາເລັດປະຕິກິລິຍາການເຊື່ອມຂອງ Ac-Ser(tBu)-OH, ລ້າງສາມເທື່ອດ້ວຍ DMF, ສາມເທື່ອດ້ວຍ DCM (dichloromethane), ແລະສາມເທື່ອດ້ວຍ methanol. ເຊັດໃຫ້ແຫ້ງພາຍໃຕ້ສູນຍາກາດເພື່ອໃຫ້ໄດ້ 23.89g ຂອງ 23.89g ຂອງ Melanotan I resin-bound peptide ທີ່ມີການປ້ອງກັນຢ່າງເຕັມສ່ວນ.

III. ການກະກຽມຂອງ Melanotan I Crude Peptide
23.89 g ຂອງສານຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະຂອງ Melanotan I resin-bound peptide ໄດ້ຖືກຈັດໃສ່ໃນກະປ໋ອງດ້ານລຸ່ມ. ຢູ່ທີ່ 0 ° C, 250 ມລຂອງຄັອກເທນ cleavage ທີ່ກຽມໄວ້ລ່ວງຫນ້າ (ປະກອບດ້ວຍ TFA: thioanisole: phenol: triisopropylsilane: ນ້ໍາ = 82.5: 7.5: 5: 3: 2 ໂດຍປະລິມານ) ໄດ້ຖືກຕື່ມຄ່ອຍໆພາຍໃຕ້ການ stirring. ປະສົມໄດ້ຖືກປະຕິກິລິຍາໃນອຸນຫະພູມຕ່ໍາສໍາລັບ 0.5 ຊົ່ວໂມງ, ປະຕິບັດຕາມໂດຍການຕິກິຣິຍາໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງສໍາລັບ 2 ຊົ່ວໂມງ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ການແກ້ໄຂຮອຍແຕກໄດ້ຖືກກັ່ນຕອງພາຍໃຕ້ສູນຍາກາດ. ການແກ້ໄຂນີ້ໄດ້ຖືກເພີ່ມຢ່າງຊ້າໆໃສ່ 2 ລິດຂອງ ice-cold ເຢັນ diethyl ether ພາຍໃຕ້ການ stirring. peptide ດິບໄດ້ຖືກແຍກອອກໂດຍການຕອງ, ລ້າງສາມເທື່ອດ້ວຍ ice-cold diethyl ether, ແລະ 8.55 g ຂອງ Melanotan I crude peptide ໄດ້ຮັບ.

IV. ການກະກຽມຂອງ Melanotan I Purified Peptide
ຂັ້ນຕອນທີ 1:ການລະລາຍຂອງ crude Melanotan I peptide ໃນ 100 ml ຂອງນ້ໍາບໍລິສຸດແລະການກັ່ນຕອງໂດຍຜ່ານເຍື່ອ 0.45 μmເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຮັບການແກ້ໄຂ peptide crude.

ຂັ້ນຕອນທີ 2:ຊໍາລະລ້າງສານຜິດ Melanotan I peptide ໂດຍໃຊ້ໂຄຣມາຕາກຣາຂອງແຫຼວປະສິດທິພາບສູງ (HPLC). ໃຊ້ຖັນການບີບອັດຕາມແກນແບບເຄື່ອນໄຫວ DAC-HB50 ກັບໄລຍະມືຖື A (0.05% trifluoroacetic acid aqueous solution) ແລະ mobile phase B (0.05% trifluoroacetic acid in acetonitrile). ດໍາເນີນການ elution gradient ສໍາລັບການແຍກແລະ purification. ກວດຫາຕົວຢ່າງໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງກວດຈັບ UV ແລະເກັບກໍາການແກ້ໄຂ peptide ທີ່ສອດຄ້ອງກັບຈຸດສູງສຸດຂອງເປົ້າຫມາຍໃນແຕ່ສ່ວນຫນຶ່ງ.

ຂັ້ນຕອນທີ 3:ຫຼັງຈາກການຊໍາລະລ້າງ HPLC, ໄດ້ຮັບ 180 ml ຂອງການແກ້ໄຂ Melanotan I trifluoroacetate ທີ່ມີຄວາມບໍລິສຸດເກີນ 99%. ສຸມໃສ່ການແກ້ໄຂໃຫ້ 50 ml ໂດຍຜ່ານການລະເຫີຍ rotary.

ຂັ້ນຕອນທີ 4:ສ້າງຄວາມສົມດຸນຂອງຖັນ chromatography ດ້ວຍນ້ໍາ deionized ແລະໂຫຼດ 50 ml ຂອງການແກ້ໄຂ Melanotan I trifluoroacetate ບໍລິສຸດ (ຄວາມບໍລິສຸດ> 99%). Elute ສໍາລັບ 50 ນາທີໃນ 2% acetic acid aqueous solution system. ສຸມໃສ່ຜະລິດຕະພັນເປົ້າຫມາຍທີ່ເກັບກໍາເປັນ 80 ມລໂດຍຜ່ານການລະເຫີຍ rotary. ດໍາເນີນການອົບແຫ້ງກ່ອນ freeze ແລະ freeze-drying ໃນທີ່ສຸດເພື່ອໃຫ້ໄດ້ 5.33 g ຂອງ Melanotan I purified peptide, ມີຜົນຜະລິດຂອງ 32.33%.